Мы уже говорили о том, что благодаря специфичности спаривания оснований (G—С и А—Т) двойная спираль ДНК сохраняет постоянную структуру независимо от последовательности нуклеотидных пар. Это означает, что индивидуальные молекулы ДНК различаются последовательностью нуклеотидов, а не значительными изменениями в структуре. (В противоположность белкам, у которых общая структура белка зависит от последовательности аминокислот, но именно эта общая структура в целом определяет биологическую функцию.) Совсем небольшие различия в нуклеотидной последовательности ДНК могут иметь очень важное значение, поскольку замена одной пары оснований вызывает мутацию.
Можно ли точно узнать нуклеотидную последовательность ДНК? Первые попытки определения нуклеотидной последовательности были повторением метода определения аминокислотной последовательности белков: расщепление молекулы на мелкие фрагменты, выяснение нуклео-тидного состава во фрагментах и (на основе данных о перекрывающихся фрагментах) восстановление полной последовательности. Однако в случае белков дело обстояло значительно проще. Наличие в белковой молекуле 20 аминокислот обусловливает большое разнообразие фрагментов, тогда как в состав молекулы ДНК входит всего четыре основания. Поэтому описанный метод можно было использовать только для очень коротких фрагментов нуклеиновых кислот.
Однако сейчас стало возможным прямо определять последовательность ДНК. Более того, эта процедура проще, чем определение белковой последовательности.
Все используемые методы определения нуклеотидной последовательности сводятся к тому, чтобы получить серию одноцепочечных молекул ДНК, различающихся по размеру на одно основание. Такие молекулы можно разделить с помощью электрофореза в акриламидном геле. Полосы, соответствующие молекулам различной длины, образуют «лестницу» длиной до 300 нуклеотидов.
Для получения таких наборов различающихся фрагментов используют в основном два подхода. В одном случае ДНК химически расщепляют по одному основанию. Другой подход заключается в том, чтобы синтезировать нужную последовательность ДНК in vitro, специфически останавливая синтез на заданном основании.
Для определения нуклеотидной последовательности молекулы ДНК ее обрабатывают четырьмя разными способами, каждый из которых специфически действует только на один тип оснований. Продукты расщепления подвергают электрофорезу, помещая их на четыре соседние дорожки одного геля. Полоски, соответствующие молекулам определенного размера, появляются только на одной из четырех дорожек. Это позволяет определить ну-клеотид, находящийся в данном положении на ДНК. Переходя от одной полоски к полоске большего размера, можно «прочитать» всю последовательность нуклеотидов.
При использовании химической обработки ДНК сначала исследуемый фрагмент метят с одного конца радиоактивным фосфором и затем специфически расщепляют полинуклеотид по одному из четырех оснований. Суть этого метода заключается в том, чтобы расщепление происходило случайно в каждом одном из чувствительных положений с вероятностью примерно 1-2%.
Таким образом, сначала препарат ДНК содержит большое число идентичных молекул, меченных с одного конца. После химической обработки каждая молекула будет разрезана только в небольшом числе участков, содержащих данное основание. Но весь препарат в целом будет состоять из набора молекул, у которых разрыв случайно произошел практически в каждом положении данного основания.
Полученные молекулы подвергают электрофорезу и радиоактивно меченные фрагменты идентифицируют радиоавтографически. Каждый фрагмент образует полоску, размер которой зависит от расстояния места разрыва до меченого конца. В результате каждого типа химической обработки образуется целая серия полосок, указывающих на положение всех соответствующих оснований по отношению к меченому концу молекулы.